Terapia fotodynamiczna i szlak TGFβ1 w leczeniu raka płaskonabłonkowego skóry

Czy terapia fotodynamiczna i szlak TGFβ1 stają się centrum zainteresowania?

Badanie przedstawione w artykule to kompleksowa analiza laboratoryjno-eksperymentalna, koncentrująca się na mechanizmach oporności na terapię fotodynamiczną (PDT) w raku płaskonabłonkowym skóry (cSCC) oraz ocenie potencjału leków N-acetylocysteiny (NAC) i raloksyfenu jako środków zwiększających skuteczność PDT.

Rak płaskonabłonkowy skóry jest najczęstszym typem raka skóry z potencjałem przerzutowym, o rosnącej częstości występowania na całym świecie. Chociaż zabieg chirurgiczny pozostaje złotym standardem leczenia, ograniczenia kosmetyczne motywują stosowanie procedur nieinwazyjnych, takich jak terapia fotodynamiczna. PDT łączy trzy elementy do indukcji śmierci komórkowej: fotouczulacz, światło o określonej długości fali i tlen cząsteczkowy. Metoda ta zyskała popularność jako minimalnie inwazyjna terapia skutecznie eliminująca zmiany nowotworowe skóry. Jedną z głównych zalet PDT jest jej selektywność – efekty cytotoksyczne ograniczają się do naświetlanego obszaru, oszczędzając otaczające zdrowe tkanki. Mimo skuteczności, niektóre komórki nowotworowe mogą rozwinąć oporność na terapię, co prowadzi do nawrotów.

W kontekście mechanizmów oporności, szczególną uwagę zwrócono na rolę transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ). TGFβ jest cytokiną występującą w trzech funkcjonalnie różnych izoformach, z których TGFβ1 jest najbardziej powszechną i odgrywa kluczową rolę w regulacji różnych procesów komórkowych. TGFβ1 wykazuje dualną rolę w nowotworach – działa jako supresor guza we wczesnych stadiach poprzez hamowanie proliferacji komórek i indukcję apoptozy, ale w późniejszych stadiach może promować progresję guza poprzez wzmacnianie przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), angiogenezę i unikanie odpowiedzi immunologicznej. W kontekście jego roli jako supresora guza, sygnalizacja TGFβ1 może indukować ekspresję białka P21, które reguluje cykl komórkowy, prowadząc do jego zatrzymania i umożliwiając komórkom nowotworowym w stanie uśpienia uniknięcie działania leków przeciwnowotworowych.

Jakie metody badawcze wskażą oporność na PDT?

Badana populacja obejmowała linie komórkowe raka płaskonabłonkowego skóry (A431 i SCC13), kultury pierwotne fibroblastów związanych z rakiem (CAF) uzyskane z biopsji pacjentów z in situ lub inwazyjnym cSCC (T165A i T205A), hodowle trójwymiarowe (sferoidy) oraz model zwierzęcy (bezwłose myszy SKH-1 poddane fotokarcinogenezie).

W badaniu wykorzystano metyloaminolewulinian (MAL) jako fotouczulacz, który po 5-godzinnej inkubacji z komórkami nowotworowymi był aktywowany czerwonym światłem o różnych dawkach. Toksyczność PDT oceniano za pomocą testu MTT w hodowlach dwuwymiarowych oraz barwienia jodkiem propidyny i oranżem akrydyny w sferoidach. Do oceny aktywacji szlaku TGFβ1/SMAD wykorzystano techniki immunofluorescencji pośredniej i Western blot, a poziomy TGFβ1 i rozpuszczalnego endoglinu mierzono metodą ELISA.

Czy modulacja TGFβ1 przez endoglin może zwiększyć skuteczność PDT?

Kluczowe wyniki badania wykazały, że medium kondycjonowane (CM) pochodzące z CAF indukowało oporność na PDT w komórkach A431 poprzez aktywację szlaku sygnałowego TGFβ1. Oporność ta była związana z zatrzymaniem cyklu komórkowego, co potwierdzono przez zwiększoną ekspresję P21 i zmniejszone włączanie EdU. Traktowanie CAF za pomocą NAC lub raloksyfenu przed pobraniem CM zapobiegało indukcji oporności na PDT w komórkach A431. Mechanizm działania tych leków obejmował zwiększenie ekspresji endoglinu (ko-receptor TGFβ1) w CAF, co prowadziło do zmniejszenia produkcji TGFβ1.

Szczególnie interesujące było odkrycie, że szlak sygnałowy TGFβ1 może być modulowany przez jego ko-receptor endoglin, który w zależności od kontekstu komórkowego może wzmacniać lub hamować wiązanie cytokiny do jej podstawowych receptorów. Endoglin jest homodimeryczną glikoproteiną błonową tworzoną przez dwie podjednostki 90 kDa, posiadającą dużą domenę zewnątrzkomórkową, pojedynczy region przezbłonowy i krótki ogon cytoplazmatyczny. Nadekspresja endoglinu błonowego może prowadzić do jego rozszczepiania, generując rozpuszczalną aktywną formę składającą się z zewnątrzkomórkowej części białka błonowego. Rozpuszczalny endoglin może wiązać TGFβ1, działając jako receptor-pułapka i hamując sygnalizację TGFβ1.

Silencing endoglinu w CAF blokował pozytywny efekt NAC, potwierdzając kluczową rolę endoglinu w zapobieganiu oporności na PDT. Badania wykazały, że poziomy endoglinu w CAF determinują wrażliwość komórek cSCC na PDT. Ekspozycja CAF T205A na rekombinowany endoglin prowadziła do zmniejszenia wydzielania TGFβ1, co potwierdza rolę tego białka w modulacji szlaku TGFβ1.

Jakie wyniki dają terapia łączona i różnice wrażliwości komórek?

W modelu zwierzęcym, terapia łączona NAC+PDT znacząco zmniejszyła liczbę i wielkość guzów skórnych w porównaniu do samej PDT lub NAC. Kombinacja terapeutyczna prowadziła również do zmniejszenia grubości naskórka, obniżenia ekspresji markera proliferacji PCNA i markera uszkodzeń P53, a także obniżenia poziomu TGFβ1 we krwi. Istotne jest, że grupa leczona kombinacją NAC+PDT była jedyną, w której nie występowały guzy o objętości powyżej 100 mm³ na końcu eksperymentu.

Interesujące było również odkrycie, że linie komórkowe cSCC różnią się wrażliwością na TGFβ1 i PDT. Komórki SCC13 wykazują wyższy poziom wydzielania TGFβ1 i niższą ekspresję HO-1, co koreluje z niższymi podstawowymi poziomami ROS i niższą podstawową wrażliwością na PDT, co można rozumieć jako wewnętrzną oporność na leczenie. Natomiast komórki A431, o niższym wydzielaniu TGFβ1 i podstawowej ekspresji HO-1, wykazują większą wrażliwość na PDT w izolacji, ale są bardziej podatne na rozwój oporności po ekspozycji na egzogenny TGFβ1.

Jakie znaczenie mikrośrodowisko i biomarkery mają w walce z opornością na PDT?

Wyniki badania mają istotne implikacje kliniczne, sugerując, że ocena biomarkerów związanych z sygnalizacją TGFβ1 i spoczynkiem komórkowym (endoglin, P-SMAD2, P21) w biopsjach guzów oraz pomiar poziomów TGFβ1 w surowicy pacjentów może pomóc przewidzieć rozwój oporności na PDT. Zastosowanie NAC lub raloksyfenu jako ko-adjuwantów PDT może stanowić skuteczną strategię terapeutyczną w leczeniu cSCC, szczególnie u pacjentów z wysokim ryzykiem rozwoju oporności.

Warto podkreślić, że oporność na leczenie może rozwinąć się również w wyniku zastosowania serii wielokrotnych sesji MAL-PDT. Wielokrotne dawki MAL-PDT wydają się mieć paradoksalny efekt: chociaż mogą być bardziej skuteczne niż pojedyncza dawka, mogą również promować selekcję i pojawienie się komórek opornych. Efekt ten zaobserwowano klinicznie, gdy u pacjentów początkowo dobrze reagujących na wielokrotne sesje MAL-PDT rozwinęły się nawracające, bardziej agresywne zmiany.

Badanie to podkreśla znaczenie mikrośrodowiska nowotworowego w rozwoju oporności na terapię i identyfikuje nowe cele terapeutyczne do optymalizacji leczenia raka płaskonabłonkowego skóry. Autorzy proponują nowe podejście polegające na repozycjonowaniu zatwierdzonych leków (NAC i raloksyfenu) jako środków zwiększających skuteczność PDT poprzez modulację szlaku TGFβ1 w mikrośrodowisku guza.

Podsumowanie

Kompleksowe badanie laboratoryjno-eksperymentalne koncentruje się na mechanizmach oporności na terapię fotodynamiczną w raku płaskonabłonkowym skóry. Kluczową rolę w rozwoju oporności odgrywa szlak transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ1), który może być modulowany przez jego ko-receptor endoglin. Badania wykazały, że medium kondycjonowane z fibroblastów związanych z rakiem indukuje oporność na PDT poprzez aktywację szlaku TGFβ1. Zastosowanie N-acetylocysteiny lub raloksyfenu zwiększa ekspresję endoglinu, co prowadzi do zmniejszenia produkcji TGFβ1 i zapobiega rozwojowi oporności. W modelu zwierzęcym terapia łączona NAC+PDT znacząco zmniejszyła liczbę i wielkość guzów skórnych. Wyniki sugerują, że ocena biomarkerów związanych z sygnalizacją TGFβ1 może pomóc w przewidywaniu rozwoju oporności na PDT, a zastosowanie NAC lub raloksyfenu jako ko-adjuwantów stanowi obiecującą strategię terapeutyczną w leczeniu cSCC.