Przełom w leczeniu zapalenia okrężnicy – kombinacja antyoksydantów daje nadzieję

Jakie mechanizmy prowadzą do zapalenia DC?

Colitis związane z dywersją jelitową (DC) to proces zapalny rozwijający się w błonie śluzowej segmentów okrężnicy pozbawionych strumienia kałowego. Od czasu pierwszego opisu tego schorzenia przez Glotzera i wsp., badania wykazały, że etiopatogeneza DC jest prawdopodobnie związana z wewnątrzświatłowym niedoborem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFAs), które stanowią główny substrat energetyczny dla komórek nabłonka okrężnicy. Gdy komórki nabłonka okrężnicy przestają otrzymywać swoje główne źródło energii, dochodzi do istotnych zmian w mechanizmach produkcji energii (łańcuch oddechowy), co prowadzi do wytwarzania dużych ilości reaktywnych form tlenu (ROS). Te ROS prawdopodobnie powodują uszkodzenia komórek błony śluzowej okrężnicy, prowadząc do rozwoju uszkodzeń wywołanych stresem oksydacyjnym i zapoczątkowując proces zapalny charakterystyczny dla DC.

Rola ROS w rozwoju DC została potwierdzona w wielu badaniach eksperymentalnych, które wykazały, że stres oksydacyjny stanowi jeden z głównych mechanizmów molekularnych związanych z pierwszymi etapami etiopatogenezy DC. ROS mogą uszkadzać kilka mechanizmów obronnych funkcjonujących w barierze nabłonkowej, takich jak warstwa śluzu pokrywająca błonę śluzową okrężnicy, białka uczestniczące w systemach adhezji komórkowej, a także mogą niszczyć błonę podstawną komórek. Potwierdzając tę hipotezę, zastosowanie substancji o działaniu antyoksydacyjnym w eksperymentalnych modelach DC wykazało zmniejszenie stanu zapalnego błony śluzowej okrężnicy oraz uszkodzeń wywołanych przez ROS w różnych mechanizmach obronnych bariery nabłonkowej okrężnicy.

Czy antyoksydanty mogą przeciwdziałać uszkodzeniom nabłonka okrężnicy?

Sukralfat (SCF) i N-acetylocysteina (NAC) to dwie substancje o istotnym działaniu antyoksydacyjnym, które są stosowane z dobrymi wynikami w różnych formach zapalenia okrężnicy, takich jak popromienne zapalenie odbytnicy, wrzodziejące zapalenie jelita grubego oraz DC. Badania eksperymentalne wykazały, że codzienne stosowanie wlewek zawierających SCF lub NAC może zmniejszać stan zapalny błony śluzowej okrężnicy oraz poziom tkankowy ROS w modelach DC. Jednakże, według naszej wiedzy, żadne badanie nie oceniało, czy zastosowanie wlewek zawierających SCF i NAC osobno lub w kombinacji jest bardziej skuteczne w redukcji stresu oksydacyjnego w eksperymentalnym modelu DC.

Jak zaprojektowano eksperymentalne badanie DC?

W przeprowadzonym badaniu eksperymentalnym wykorzystano 48 szczurów Wistar, u których wykonano zabieg dywersji strumienia kałowego poprzez wytworzenie dwóch stomii. Badania przeprowadzono zgodnie z zasadami określonymi przez prawo federalne nr 11.794 i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną ds. Badań na Zwierzętach Uniwersytetu São Francisco. Zabieg dywersji strumienia kałowego przeprowadzono według wcześniej zwalidowanego modelu eksperymentalnego DC. U wszystkich zwierząt wykonano znieczulenie ogólne poprzez domięśniowe podanie roztworu ketaminy i ksylazyny. Pobrano 2-centymetrowy segment lewej okrężnicy zlokalizowany 9 cm powyżej grudki Peyera, aby utworzyć grupę pozorowaną (okrężnica ze strumieniem kałowym). Pozostały segment lewej okrężnicy wyprowadzono na zewnątrz przez okrągły otwór w skórze o średnicy 3 mm (kolostomia proksymalna). Dystalny segment okrężnicy wyprowadzono przez inny, ogonowy otwór w skórze, tworząc stomię dystalną. Przed przymocowaniem stomii dystalnej do skóry, dystalną okrężnicę dokładnie oczyszczono infuzją soli fizjologicznej o temperaturze 37°C, aż do całkowitego usunięcia resztkowej zawartości kałowej.

Po 12 tygodniach od zabiegu, gdy rozwinęło się DC, zwierzęta podzielono na cztery podgrupy, otrzymujące codziennie wlewki z: solą fizjologiczną (grupa kontrolna), SCF (2 g/kg/dzień), NAC (100 mg/kg/dzień) lub kombinacją SCF i NAC przez okres dwóch lub czterech tygodni. W obu grupach eksperymentalnych otrzymujących NAC, substancję tę rozpuszczono w buforowanym fosforanem roztworze soli (PBS), a jej kwaśne pH dostosowano za pomocą NaOH (2 M) do pH 7,4. Aby ustandaryzować szybkość i czas aplikacji, wlewki podawano wszystkim zwierzętom za pomocą pompy infuzyjnej, ze standardową szybkością pompy 2 ml/min.

Po zakończeniu interwencji pobrano segmenty okrężnicy do analiz histologicznych oraz oznaczeń biochemicznych, obejmujących poziom mieloperoksydazy (MPO) jako wskaźnika infiltracji neutrofilów, dialdehydu malonowego (MDA) jako markera peroksydacji lipidów oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych: katalazy (CAT), dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i zredukowanego glutationu (GSH).

Czy kombinacja SCF i NAC przynosi lepsze efekty?

Wyniki badania wykazały, że poziomy MPO były niższe w segmentach z zachowanym przepływem kałowym (grupa sham) w porównaniu z grupą otrzymującą samą sól fizjologiczną, niezależnie od czasu interwencji. Poziomy stresu oksydacyjnego, mierzone zawartością tkankową MDA, były również niższe w segmentach okrężnicy z zachowanym przepływem kałowym. Innymi słowy, utrzymanie przepływu kałowego zmniejszało tworzenie ROS, a w konsekwencji stopień uszkodzeń tkankowych wywołanych stresem oksydacyjnym. Obserwowano również wyższą aktywność tkankową trzech analizowanych systemów antyoksydacyjnych (CAT, SOD i GSH) w segmentach z zachowanym przepływem kałowym w porównaniu z grupą otrzymującą samą sól fizjologiczną.

Analiza histologiczna wykazała, że diagnoza zapalenia okrężnicy była stawiana przez dwóch różnych patologów na podstawie trzech niezależnych parametrów histologicznych: skrócenia krypt, infiltracji neutrofilów do błony śluzowej i utraty nabłonka. Zmienne te stratyfikowano według stopnia nasilenia każdej z nich, od braku zmian (+) do intensywnych zmian (++++). Dla wszystkich analizowanych zmiennych, ostateczna wartość uznana dla każdego zwierzęcia była średnią wartością po ilościowej ocenie trzech różnych pól histologicznych.

W porównaniu ze zwierzętami otrzymującymi SCF lub NAC osobno, te otrzymujące emulsję zawierającą obie substancje w kombinacji wykazywały znacząco niższe wskaźniki stanu zapalnego, poziomy MPO i MDA niż grupa kontrolna otrzymująca tylko sól fizjologiczną. Poziomy tkankowe CAT i SOD były znacząco wyższe niż w grupie kontrolnej, ale podobne do tych obserwowanych w interwencjach z substancjami stosowanymi osobno. Podsumowując, wyniki tego badania sugerują, że stosowanie wlewek zawierających emulsję obu substancji może skuteczniej zmniejszać stan zapalny i stres oksydacyjny w segmentach okrężnicy z DC.

Czy SCF skutecznie chroni nabłonek okrężnicy?

Mechanizm działania SCF związany jest z jego wysoką zdolnością do przylegania do zapalnie zmienionego i owrzodzonego nabłonka. Jednakże działanie cytoprotekcyjne SCF na nabłonek przewodu pokarmowego jest bardziej złożone i związane z różnymi mechanizmami działania. Kochhar i wsp. byli pierwszymi autorami, którzy wykazali skuteczność stosowania wlewek zawierających SCF w kontrolowaniu krwawienia z odbytnicy wynikającego z popromiennego zapalenia odbytnicy. Później korzystne efekty wlewek z SCF wykorzystano w leczeniu innych form zapalnych chorób jelit, które prowadziły do tworzenia się owrzodzeń nabłonka. Stosując eksperymentalne modele DC, wykazano, że stosowanie wlewek z SCF może zmniejszać proces zapalny w błonie śluzowej okrężnicy wyłączonej ze strumienia kałowego, chroniąc różne mechanizmy obronne działające na barierze nabłonkowej błony śluzowej i zmniejszając poziom stresu oksydacyjnego tkanek.

Miejscowe stosowanie SCF ma również działanie antyoksydacyjne i może neutralizować tworzenie ROS wytwarzanych przez neutrofile obecne w zapalnie zmienionej tkance. To działanie antyoksydacyjne chroni przed peroksydacją lipidów będących składnikami błon komórkowych, drugiej linii obrony nabłonka, chroniąc błonę śluzową przewodu pokarmowego przed stresem oksydacyjnym tkanek. Oceniając indywidualne efekty stosowania wlewek zawierających SCF w tym badaniu eksperymentalnym, stwierdzono, że SCF zmniejszał poziom MDA niezależnie od czasu interwencji, co wskazuje na jego działanie antyoksydacyjne. Ustalenia te zostały potwierdzone, gdy wykazano utrzymanie poziomów tkankowych składników systemu antyoksydacyjnego (CAT, SOD i GSH). Tak więc zmniejszenie poziomu MDA w komórkach błony śluzowej okrężnicy było związane ze stosowaniem SCF. Wyniki te mogą być związane nie tylko z jego działaniem antyoksydacyjnym, ale także z jego wysoką zdolnością do adhezji i ochrony zapalnie zmienionej błony śluzowej.

Czy NAC może wspomagać terapię zapalenia DC?

NAC jest substancją o uznanym działaniu antyoksydacyjnym zarówno in vitro, jak i in vivo, stosowaną w leczeniu różnych chorób zapalnych. NAC jest uważana za cząsteczkę o dużej aktywności antyoksydacyjnej w organizmie ludzkim i wykazuje różnorodne działania terapeutyczne. Shirazi i wsp. potwierdzili, że w porównaniu z placebo, NAC ma znacząco pozytywny wpływ na utrzymanie remisji ataków u pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, którzy są w fazie redukcji terapii steroidowej.

Badania na modelach chemicznie indukowanego zapalenia okrężnicy wykazały, że NAC poprawia proces zapalny błony śluzowej poprzez usuwanie ROS tworzonych podczas komórkowego metabolizmu energetycznego. Stosowanie wlewek zawierających NAC zmniejszało stan zapalny w zapaleniu okrężnicy wywołanym siarczanem dekstranu i kwasem octowym poprzez usuwanie ROS tworzonych przez proces zapalny i zwiększanie aktywności systemów antyoksydacyjnych błony śluzowej okrężnicy. Jednakże, pomimo skuteczności terapeutycznej NAC w chemicznie indukowanym zapaleniu okrężnicy, jego efekty rzadko były testowane w modelach DC. Niewiele badań donosi, że doodbytnicze stosowanie NAC zmniejszało proces zapalny błony śluzowej, a także poziom stresu oksydacyjnego tkanek w eksperymentalnym modelu DC. Tak więc wlewki z NAC mogłyby stać się korzystną uzupełniającą strategią terapeutyczną w kontrolowaniu ograniczających objawów DC, poprawiając jakość życia osób, które już żyją z trudnościami posiadania stomii. Jednakże niska zdolność NAC do przylegania do powierzchni błony śluzowej okrężnicy wyłączonej z przepływu wymagała stosowania substancji w postaci wlewek kilka razy dziennie, co zmniejszało przestrzeganie przez pacjentów tej strategii terapeutycznej. To właśnie z powodu niskiej przyczepności NAC do powierzchni błony śluzowej okrężnicy pojawił się pomysł stosowania jej w połączeniu z cząsteczką SCF, która ma wysoką zdolność przylegania do błony śluzowej.

Badanie wykazało, że stosowanie wlewek zawierających izolowany NAC zmniejszało wskaźnik zapalny, poziom infiltracji neutrofilów (mierzony poziomem MPO) oraz poziom stresu oksydacyjnego tkanek (oceniany poziomem MDA w tkankach). Stosowanie izolowanego NAC znacząco zwiększało poziomy tkankowe składników systemu antyoksydacyjnego CAT, SOD i GSH, głównie w pierwszych dwóch tygodniach interwencji, co potwierdza antyoksydacyjną moc substancji. Wzrost składników systemu antyoksydacyjnego mógł być mniejszy po czterech tygodniach z powodu niższej syntezy tych enzymów z powodu pozbawienia SCFAs, głównego substratu energetycznego do syntezy białek.

Tylko jedno badanie wcześniej oceniało skutki kombinacji wlewek zawierających emulsję SCF i NAC w eksperymentalnym modelu DC. Autorzy wykazali, że kombinacja tych dwóch substancji zwiększała produkcję mucyn w nabłonku okrężnicy, zwiększając ochronę komórek błony śluzowej przed ROS. Wlewki zawierające kombinację obu substancji były w stanie zmniejszyć stopień zapalenia błony śluzowej, poprawiając gojenie się wyłączonej błony śluzowej. Jednakże autorzy nie oceniali, czy kombinacja obu substancji miała lepszy efekt antyoksydacyjny niż efekt obu substancji stosowanych osobno.

Biorąc pod uwagę, że SCF i NAC mają działanie przeciwzapalne, antyoksydacyjne i regeneracyjne, niniejsze badanie zostało zaprojektowane w celu oceny zdolności obu substancji do zmniejszania zapalnych uszkodzeń tkanek i ich efektów antyoksydacyjnych w błonie śluzowej okrężnicy pozbawionej strumienia kałowego. W porównaniu ze zwierzętami, które otrzymywały SCF lub NAC osobno, te, które otrzymywały emulsję z obiema substancjami w kombinacji, prezentowały znacząco niższe wskaźniki zapalne, MPO i MDA niż grupa kontrolna, która otrzymywała tylko sól fizjologiczną. Poziomy tkankowe CAT i SOD były znacząco wyższe niż w grupie kontrolnej, ale podobne do tych w interwencji z substancjami stosowanymi osobno.

Jakie są ograniczenia badań i przyszłe perspektywy?

Jednakże badanie to ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, było to badanie na eksperymentalnym modelu DC. Ze względu na ograniczenia etyczne, użyto małej liczby zwierząt w każdej grupie. Możliwe, że przy użyciu większej liczby zwierząt w każdej grupie wyniki mogłyby być inne. Aby zminimalizować ten problem, do analizy wyników użyto testów nieparametrycznych. Ponieważ przeprowadzono badanie eksperymentalne na szczurach, wyniki należy interpretować z ostrożnością i transponować na ludzi dopiero po przeprowadzeniu dobrze zaprojektowanych badań klinicznych. Jednakże, ponieważ obie substancje są już częścią arsenału terapeutycznego u ludzi i nie wykazują poważnych działań niepożądanych, badania u ludzi mogą być bezpiecznie przeprowadzone.

Podsumowując, wlewki z SCF i NAC stosowane osobno lub w kombinacji mogą zmniejszać stan zapalny, infiltrację neutrofilów i stres oksydacyjny w segmentach okrężnicy pozbawionych strumienia kałowego, co może stanowić nową, obiecującą opcję terapeutyczną dla pacjentów z DC.

Podsumowanie

Przedstawione badanie eksperymentalne koncentruje się na mechanizmach prowadzących do zapalenia okrężnicy związanego z dywersją jelitową (DC) oraz możliwościach jego leczenia. Główną przyczyną DC jest niedobór krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, prowadzący do zwiększonej produkcji reaktywnych form tlenu (ROS) i uszkodzeń tkanki. W badaniu na szczurach testowano skuteczność dwóch substancji antyoksydacyjnych – sukralfatu (SCF) i N-acetylocysteiny (NAC), podawanych osobno oraz w kombinacji. Wyniki wykazały, że połączenie obu substancji było najbardziej efektywne w redukcji stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego. SCF wykazał wysoką zdolność przylegania do nabłonka i działanie ochronne, podczas gdy NAC skutecznie neutralizował ROS i wzmacniał systemy antyoksydacyjne. Mimo ograniczeń badania, kombinacja SCF i NAC może stanowić obiecującą opcję terapeutyczną dla pacjentów z DC.