N-acetylocysteina skuteczna w walce z melioidozą – przełomowe odkrycie naukowe

Czy melioidoza stawia przed nami wyzwania?

Bakteria Burkholderia pseudomallei jest czynnikiem etiologicznym melioidozy, potencjalnie śmiertelnej choroby zakaźnej, występującej głównie w Azji Południowo-Wschodniej i północnej Australii. Globalne obciążenie melioidozą szacuje się na około 165 000 przypadków i prawie 90 000 zgonów rocznie. Cukrzyca, której częstość występowania na świecie rośnie, dodatkowo zwiększa ryzyko melioidozy i znacząco przyczynia się do wysokiej śmiertelności z jej powodu. Światowa Organizacja Zdrowia klasyfikuje tę chorobę jako zaniedbywaną chorobę tropikalną. Pomimo dostępności dobrze ustalonych protokołów leczenia, ograniczony dostęp do opieki zdrowotnej i zasobów terapeutycznych w obszarach endemicznych pozostaje znaczącym wyzwaniem w minimalizowaniu ciężkości choroby, wskaźników śmiertelności i pojawiania się oporności na antybiotyki. W związku z tym nowe podejścia terapeutyczne, w tym stosowanie przystępnych cenowo środków o nowym zastosowaniu, mogą być obiecującą strategią skuteczniejszego leczenia melioidozy.

Czynniki wirulencji produkowane przez B. pseudomallei oraz wewnątrzkomórkowy charakter tej bakterii pomagają patogenowi przetrwać poprzez manipulowanie odpowiedzią immunologiczną gospodarza. Biofilmy tworzone przez B. pseudomallei utrudniają dyfuzję antybiotyków, co w konsekwencji prowadzi do oporności na antybiotyki. Dodatkowo, tworzenie biofilmu ułatwia patogenezę komórkową w ludzkich komórkach nabłonka płuc i indukuje odpowiedź prozapalną. Fenotyp tworzenia biofilmu przez B. pseudomallei jest również związany z uwalnianiem pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NETs), które zawierają znaczne ilości zewnątrzkomórkowego DNA (eDNA). To eDNA umożliwia patogenowi przetrwanie ataku neutrofili. Ponadto badania wykazały, że NETs nie zapobiegały rozprzestrzenianiu się B. pseudomallei w modelach mysich i wykazywały ograniczoną aktywność bakteriobójczą. Zamiast tego NETs przyczyniają się do tworzenia biofilmu, wspierają przetrwanie patogenu i nasilają uszkodzenie tkanki płucnej, co zaobserwowano w zakażeniach wywołanych przez Francisella tularemia i Pseudomonas aeruginosa. Nasze wcześniejsze badanie podkreśliło kluczową rolę eDNA w inicjowaniu tworzenia biofilmu przez B. pseudomallei. Jednak szczegółowy wpływ DNA uwalnianego z NETs na tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei, które jest związane z przetrwaniem patogenu, nie został jeszcze w pełni wyjaśniony.

Czy NAC hamuje szkodliwe działanie NETs?

N-acetylocysteina (NAC) jest niedrogim, wielofunkcyjnym środkiem terapeutycznym, wykazuje minimalną toksyczność i została zatwierdzona do zastosowań klinicznych w licznych stanach klinicznych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. Poza rolą środka mukolitycznego, związku detoksykującego i hepatoprotekcyjnego, antyoksydantu i środka przeciwzapalnego, NAC wykazała znaczącą aktywność przeciwbakteryjną i przeciwbiofilmową. Efekty te zaobserwowano wobec patogenów endodontycznych, takich jak Actinomyces naeslundii, Lactobacillus salivarius, Streptococcus mutans i Enterococcus faecalis, a także P. aeruginosa oraz patogenów układu oddechowego, w tym Haemophilus influenzae bez typu, Moraxella catarrhalis i P. aeruginosa. Wstępne leczenie neutrofili NAC skutecznie blokowało uwalnianie NET indukowane przez piocjaninę, co skutkowało zmniejszeniem eDNA generowanego z NETs stymulowanych przez P. aeruginosa i NETs stymulowanych przez fosforan-12-mirystynian-13-octanu (PMA). Ponadto NAC wykazuje znaczącą aktywność przeciwbakteryjną i skutecznie hamuje tworzenie biofilmu oraz niszczy istniejące biofilmy w różnych zakażeniach bakteryjnych, w tym wywołanych przez patogeny układu oddechowego, patogeny endodontyczne i P. aeruginosa.

Tworzenie NETs jest dobrze znaną aktywnością przeciwbakteryjną. Jednak podczas gdy B. pseudomallei jest zdolna do indukowania tworzenia NET, proces ten nie zapobiega rozprzestrzenianiu się bakterii ani zapaleniu, co zaobserwowano w mysim modelu zakażenia. Pomimo indukcji NETs i uwolnienia znacznej ilości eDNA, mechanizm ten nie prowadzi do eradykacji patogenu, co sugeruje potencjalny związek między przetrwaniem bakterii a stymulacją NET. Stawiamy hipotezę, że eDNA pochodzące z NETs może w rzeczywistości promować tworzenie biofilmu, ponieważ eDNA zostało wcześniej zidentyfikowane jako kluczowy składnik rozwoju biofilmu B. pseudomallei. Aby to rozwiązać, nasze badanie ma na celu ocenę wpływu eDNA pochodzącego z NETosis na tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei. Ponadto zbadaliśmy zastosowanie NAC podczas współhodowli B. pseudomallei z neutrofilami, aby ocenić jego wpływ na stymulację NET, rozwój biofilmu zależnego od NET przez B. pseudomallei i eradykację patogenu przez neutrofile.

Czy NETs sprzyjają, a NAC hamują rozwój biofilmu?

Nasze badania wykazały, że NETs znacząco zwiększają tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei H777 w porównaniu do kontroli, fNETs (filtrowanych NETs) i sPMN (supernatant z niestymulowanych neutrofili) (p < 0,0001). Obrazy z mikroskopii konfokalnej (CLSM) potwierdziły, że NETs znacząco promowały 48-godzinny biofilm B. pseudomallei H777 w porównaniu do obecności sPMN i fNETs. Analiza COMSTAT wykazała, że biomasa 48-godzinnego biofilmu i zawartość eDNA w biofilmie eksponowanym na NETs były znacząco wyższe niż w kontrolach i fNETs (p < 0,001, p < 0,0001). Te odkrycia ujawniły wpływ NETs zawierających DNA na zwiększenie zdolności B. pseudomallei H777 do tworzenia biofilmu.

Badania wykazały również, że neutrofile wstępnie traktowane NAC w stężeniach 0,1, 1, 10 lub 15 mM przez 5 minut wykazywały skuteczność NAC w zapobieganiu tworzeniu NETs stymulowanych przez B. pseudomallei przy MOI 10. Wyższe stężenia NAC (20 i 50 mM) zmieniały morfologię neutrofili, dlatego do dalszych badań wybrano 15 mM NAC. Test MTT wykazał, że neutrofile i komórki A549 traktowane 15 mM NAC wykazywały odpowiednio 90% i 87% żywotności w porównaniu z nieleczonymi kontrolami, co wskazuje, że leczenie mieści się w akceptowalnym zakresie bezpieczeństwa komórkowego.

Czy NAC wpływa na architekturę biofilmu w obecności neutrofili?

Tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei H777 współhodowanego z neutrofilami przy MOI 10 wykazało statystycznie istotny wzrost w porównaniu z grupami kontrolnymi bez neutrofili (p < 0,0001). Ponadto obecność NAC podczas początkowych 3 godzin współhodowli B. pseudomallei z neutrofilami znacząco zmniejszyła tworzenie biofilmu w porównaniu do współhodowli bez NAC. Co godne uwagi, po 48 godzinach inkubacji B. pseudomallei z neutrofilami i NAC prawie nie wykryto biofilmu. Ustalenia te wskazują na wpływ NAC na tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei pod wpływem neutrofili.

Obrazy CLSM ilustrowały większą grubość biofilmu B. pseudomallei H777 podczas współhodowli z neutrofilami w porównaniu z kontrolami. Ponadto biofilm B. pseudomallei współhodowany z neutrofilami w obecności NAC przez początkowe 3 godziny wykazywał zmniejszoną grubość biofilmu. Co godne uwagi, biofilm B. pseudomallei H777 podczas współhodowli z neutrofilami w obecności NAC przez 48 godzin był ledwo wykrywalny. Analiza biomasy biofilmu i eDNA w biofilmach przeprowadzona za pomocą analiz COMSTAT podkreśliła wpływ neutrofili w zwiększaniu biomasy biofilmu (p < 0,0001) i eDNA (p < 0,01) w biofilmach B. pseudomallei w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Ponadto obecność NAC podczas pierwszych 3 godzin spowodowała statystycznie istotne zmniejszenie biofilmu (p < 0,001) i eDNA (p < 0,01). Ciągła obecność NAC przez 48 godzin podczas interakcji B. pseudomallei i neutrofili drastycznie zmniejszyła biomasę biofilmu (p < 0,0001) i eDNA (p < 0,0001) w porównaniu do biofilmu wytworzonego podczas współhodowli bez NAC.

Jak NAC wpływa na wzrost i żywotność B. pseudomallei?

Obecność NAC wykazano jako czynnik hamujący rozwój biofilmu przez B. pseudomallei, co sugeruje, że NAC może wpływać na przeżycie bakterii. W związku z tym przeprowadzono dalsze badania wpływu NAC na wzrost pięciu klinicznych szczepów B. pseudomallei podczas inkubacji w bulionie LB zawierającym 15 mM NAC przez 24 godziny, równolegle z samym bulionem LB. Wyniki wykazały, że 15 mM NAC znacząco hamowało wzrost wszystkich szczepów B. pseudomallei (działanie bakteriostatyczne) w porównaniu z kontrolą, co monitorowano kinetycznie przez 24 godziny przy OD₆₀₀.

Podwyższony stosunek żywych do martwych komórek obserwowany w komórkach biofilmu B. pseudomallei współhodowanych z neutrofilami podkreśla wpływ neutrofili na żywotność komórek biofilmu. Natomiast leczenie 15 mM NAC przez 3-48 godzin znacząco zmniejszyło biomasę biofilmu i stosunek żywych do martwych komórek B. pseudomallei w macierzy biofilmu w porównaniu z nieleczonymi kontrolami. Obserwowany spadek biomasy biofilmu i współczynnika żywotności podkreśla hamujący wpływ NAC na wzrost B. pseudomallei.

Czy NAC poprawia zdolność neutrofili do zwalczania bakterii?

Dalsza analiza współhodowli neutrofili i B. pseudomallei wykazała znacznie wyższy wskaźnik przeżywalności B. pseudomallei w porównaniu do samego patogenu. Jednak dodanie DNazy I, która degradowała eDNA z NETs, znacząco zmniejszyło przeżywalność patogenu w porównaniu z nieleczoną konfiguracją współhodowli. Obecność zarówno DNazy I, jak i cytochalazyny D, która hamuje fagocytozę, również obniżyła przeżywalność patogenu w porównaniu z warunkami bez tych czynników. Co ciekawe, obecność NAC w systemie drastycznie zmniejszyła przeżywalność B. pseudomallei w obecności neutrofili.

Nasze odkrycia ujelniły znaczącą interakcję między fragmentami NET zawierającymi DNA, które zwiększały biomasę biofilmu B. pseudomallei w obecności neutrofili, przyczyniając się do przetrwania patogenu. Obecność NAC w stężeniu 15 mM hamowała NETs stymulowane przez B. pseudomallei, co skutkowało zmniejszeniem biofilmu B. pseudomallei podczas współhodowli z neutrofilami. Ponadto 15 mM NAC hamowało również wzrost wszystkich pięciu badanych klinicznych izolatów B. pseudomallei. Dodatkowo 15 mM NAC nie tylko hamowało tworzenie NET, ale także zwiększało zabijanie B. pseudomallei przez neutrofile poprzez fagocytozę i degranulację. Te ustalenia sugerują wpływ 15 mM NAC na hamowanie NET, a tym samym wzmocnienie funkcji neutrofili wraz z hamowaniem wzrostu i tworzenia biofilmu przez B. pseudomallei. Wyniki empiryczne w tym badaniu dostarczają nowych informacji demonstrujących znaczną skuteczność NAC w obniżaniu przeżywalności B. pseudomallei w obecności neutrofili poprzez zapobieganie efektom związanym z NET.

Czy NAC to obiecujący środek terapeutyczny w leczeniu melioidozy?

Początkowe ustalenia tego badania wykazały, że fragmenty NET, w których głównym składnikiem jest DNA, znacząco zwiększają tworzenie biofilmu przez B. pseudomallei. To badanie szeroko wspiera pracę innych badań w tej dziedzinie, łącząc NETs z tworzeniem biofilmu bakteryjnego, o którym wiadomo, że ma szkodliwy wpływ na różne choroby bakteryjne. DNA z NETs może być włączone do macierzy biofilmu i stanowić podstawę do rozwoju biofilmu, który chroni patogen przed dalszym atakiem. NETosis aktywowany przez interferon typu I promował rozwój biofilmu P. aeruginosa i przyczyniał się do jego przetrwania w zakażonych płucach modelu mysiego. Neutrofile ułatwiają początkowe etapy tworzenia biofilmu przez mały inokulum P. aeruginosa, co przypisuje się włączeniu DNA do struktury biofilmu. Rekrutacja neutrofili w zakażeniach rogówki prowadziła do tworzenia NET, co skutkowało ograniczeniem P. aeruginosa, ale ułatwiało produkcję biofilmu ocznego przez patogen, który był oporny na antybiotyki i zabijanie przez neutrofile, pogłębiając patologię oka. Sugestie dotyczące pochodzenia eDNA w biofilmach bakteryjnych obejmują same bakterie, komórki tkanek gospodarza, NETs i fagi, które są krytycznie zaangażowane w zakażenia związane z biofilmem. Nasze nowe odkrycia pomagają w interpretacji naszych wcześniejszych obserwacji, które wykazały, że B. pseudomallei indukowała NETs z dużą ilością eDNA, aby ograniczyć patogen, ale nie zdołała go wyeliminować. Być może DNA z fragmentów NET zwiększyło zdolność B. pseudomallei do tworzenia biofilmu, chroniąc w ten sposób patogen przed mechanizmami odpornościowymi gospodarza i środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Konieczne są dalsze badania w celu zbadania i oceny związków zdolnych do zapobiegania tworzeniu NET, łagodząc w ten sposób ich szkodliwy wpływ na pacjentów. Jednak ten wynik jest sprzeczny z wcześniejszym doniesieniem, które sugerowało, że w zakażeniach związanych z biofilmem in vivo z P. aeruginosa, eDNA z nekrotycznych neutrofili (nie wynik NETosis) głównie gromadzi się poza biofilmami.

Dowody z badań in vitro wykazały, że NAC posiada silną aktywność przeciwbakteryjną i skutecznie zakłóca tworzenie biofilmu. Aktywność przeciwbakteryjna 15 mM NAC na wszystkie pięć testowanych klinicznych szczepów B. pseudomallei jest zgodna z aktywnością przeciwdrobnoustrojową i przeciwbiofilmową NAC wobec różnych patogenów Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, Stenotrophomonas maltophilia, kompleksu Burkholderia cepacia i P. aeruginosa. Aktywność przeciwbakteryjna NAC może obejmować konkurencyjne hamowanie wykorzystania cysteiny lub, alternatywnie, interakcję z białkami komórkowymi bakterii poprzez ich grupę sulfhydrylową (-SH), prowadząc do nieodwracalnego uszkodzenia białek niezbędnych do wzrostu i metabolizmu, i może powodować odłączenie biofilmu patogenu.

Ustalenia tego badania wskazują, że 15 mM NAC, stężenie w akceptowalnym zakresie bezpieczeństwa komórkowego, znacząco hamuje wzrost B. pseudomallei i tworzenie biofilmu w obecności neutrofili. Zastosowanie NAC poprawiło bezpośrednie funkcje przeciwdrobnoustrojowe osób z cukrzycą leczonych glibenklamidem, które doświadczyły upośledzonych odpowiedzi neutrofili przeciwko B. pseudomallei. NAC jest wielofunkcyjnym czynnikiem, który może hamować tworzenie NET poprzez modulowanie poziomów ROS w sposób zależny od czasu i dawki, który można zastosować w chorobach związanych z NET. Wykazano również, że NAC znacząco zmniejsza produkcję zewnątrzkomórkowych polisacharydów i biofilmu bakteryjnego na stałych powierzchniach. Nebulizowany NAC w wysokiej dawce wpływa na wzrost bakterii i uwalnianie pęcherzyków błonowych w patogenach układu oddechowego, takich jak Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis Streptococcus pneumoniae i P. aeruginosa, korzystnie wpływając na pacjentów z zakażeniami bakteryjnymi dróg oddechowych. W przeciwieństwie do tego, stwierdzono, że interakcja NAC i transferryny surowicy zwiększa tworzenie biofilmu bakteryjnego, a nie hamuje go.

Podsumowanie

Melioidoza, wywoływana przez bakterię Burkholderia pseudomallei, stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego, szczególnie w regionach Azji Południowo-Wschodniej i północnej Australii. Bakteria ta tworzy biofilmy i wykorzystuje pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili (NETs) do przetrwania w organizmie gospodarza. Badania wykazały, że DNA uwalniane z NETs paradoksalnie wspomaga rozwój biofilmu bakteryjnego, zamiast zwalczać infekcję. N-acetylocysteina (NAC) okazała się skutecznym środkiem w walce z tym patogenem – w stężeniu 15 mM hamuje tworzenie NETs, ogranicza rozwój biofilmu bakteryjnego i wspomaga naturalne mechanizmy obronne neutrofili. NAC wykazuje działanie bakteriostatyczne wobec B. pseudomallei i znacząco zmniejsza przeżywalność bakterii w obecności neutrofili. Te odkrycia sugerują, że NAC może być obiecującym, przystępnym cenowo środkiem terapeutycznym w leczeniu melioidozy, szczególnie ze względu na jego wielokierunkowe działanie i niską toksyczność.