Antyoksydanty chronią psią krew przed stresem oksydacyjnym podczas przechowywania

Czy antyoksydanty chronią psą krew przed stresem oksydacyjnym?

Stres oksydacyjny podczas przechowywania krwi psów można ograniczyć dzięki antyoksydantom – wskazują nowe badania. Zespół naukowców przeprowadził nowatorskie badanie oceniające wpływ dodatku substancji przeciwutleniających na jakość przechowywanych psich koncentratów krwinek czerwonych (pRBC). Wyniki sugerują, że kombinacja antyoksydantów może skutecznie zmniejszać akumulację reaktywnych form tlenu w przechowywanej krwi.

Standardowy protokół przechowywania psich pRBC zakłada maksymalny czas 42 dni, jednak w trakcie tego okresu dochodzi do stopniowych zmian w krwinkach czerwonych, określanych jako „uszkodzenia przechowalnicze”. Te zmiany obejmują zwiększoną kruchość osmotyczną i lizę komórek, co może prowadzić do reakcji poprzetoczeniowych i zmniejszonej skuteczności transfuzji. Stres oksydacyjny jest uważany za najistotniejszy czynnik przyczyniający się do tych uszkodzeń.

„Erytrocyty ze względu na swoją funkcję transportu tlenu są stale narażone na reaktywne formy tlenu, co czyni je szczególnie podatnymi na uszkodzenia oksydacyjne podczas przechowywania” – wyjaśniają autorzy badania.

Jak przeprowadzono badanie z dodatkiem antyoksydantów?

W badaniu wykorzystano 9 jednostek psich pRBC poddanych leukoredukcji, które następnie podzielono na trzy grupy: kontrolną (z dodatkiem soli fizjologicznej), grupę z dodatkiem N-acetylocysteiny (NAC) i kwasu askorbinowego (AA) oraz grupę z analogiem witaminy E (VE) i kwasem askorbinowym. Próbki były monitorowane w dniach 1, 7, 28 i 42 przechowywania.

Jednostki krwi zostały pozyskane od Animal Blood Resources International (ABRI), który jest licencjonowanym przez Departament Rolnictwa USA ośrodkiem badawczym. Dawcy krwi zostali przebadani zgodnie z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi badań przesiewowych psich i kocich dawców krwi pod kątem patogenów przenoszonych przez krew. Krew pobrano do komercyjnie dostępnych worków z leukoredukcją zawierających antykoagulant cytrynianowo-fosforanowo-dekstrozowo-adeninowy, a następnie przefiltrowano przez filtr leukoredukcyjny. Po odwirowaniu i oddzieleniu osocza, końcowy produkt RBC zawieszono w roztworze soli fizjologicznej, adeniny, glukozy i mannitolu.

Badacze przygotowali roztwory antyoksydantów o odpowiednich stężeniach: NAC i AA rozcieńczono do 10-mmol roztworów wyjściowych przy użyciu wody dejonizowanej, a analog witaminy E (Trolox) rozcieńczono do 10-mmol roztworu wyjściowego przy użyciu roztworu buforowanego fosforanami (PBS). Dla Grupy 2 zastosowano 0,5 mmol NAC + 0,23 mmol AA, a dla Grupy 3 – 125 μmol VE + 0,23 mmol AA.

Najciekawsze wyniki dotyczyły pomiarów wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS). Grupa otrzymująca kombinację witaminy E i kwasu askorbinowego wykazała znacząco niższą akumulację ROS w porównaniu z grupą kontrolną i grupą NAC+AA. Ta ochrona przed stresem oksydacyjnym utrzymywała się przez cały okres przechowywania.

Do pomiaru akumulacji wewnątrzerytrocytarnych ROS wykorzystano cytometrię przepływową, metodę wcześniej zwalidowaną u psów. Badacze zastosowali fluorochrom 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceinę dioctanową, który reaguje z ROS wewnątrz komórek, emitując fluorescencję mierzalną przez cytometr przepływowy. Próbki poddano również stymulacji nadtlenkiem wodoru, aby ocenić reakcję komórek na dodatkowy stres oksydacyjny.

Czy antyoksydanty wpływają na jakość przechowywanej krwi psów?

Czy dodatek antyoksydantów może wydłużyć okres przydatności krwi do transfuzji? Pytanie to pozostaje otwarte, ponieważ mimo redukcji ROS, wszystkie grupy wykazywały podobny spadek poziomu glutationu (GSH) – kluczowego wewnątrzkomórkowego antyoksydantu. Ponadto we wszystkich próbkach obserwowano podobne zmiany morfologiczne erytrocytów, z dominującymi echinocytami (krwinkami czerwonymi o nieregularnym, kolczastym kształcie).

Stężenie GSH mierzono w hemolizatach erytrocytów za pomocą metody recyklingu enzymatycznego z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego zestawu. Ta metoda wykorzystuje reakcję grupy sulfhydrylowej GSH z odczynnikiem Ellmana, która prowadzi do produkcji żółtego kwasu 5-tio-2-nitrobenzoesowego (TNB). Szybkość produkcji TNB jest bezpośrednio proporcjonalna do stężenia GSH w próbce.

Interesujące jest, że zmiany kształtu erytrocytów wystąpiły już w pierwszym dniu badania i utrzymywały się przez cały okres przechowywania. Badacze sugerują, że może to wynikać z unikalnych cech psich erytrocytów, które różnią się od ludzkich pod względem wewnątrzkomórkowych stężeń elektrolitów oraz zawartości enzymów antyoksydacyjnych.

„Psie erytrocyty zawierają tylko jedną trzydziestą ilości katalazy – powszechnego enzymu antyoksydacyjnego – w porównaniu z ludzkimi erytrocytami, co może czynić je bardziej podatnymi na uszkodzenia oksydacyjne podczas przechowywania” – podkreślają autorzy.

W przeciwieństwie do ludzkich erytrocytów, które charakteryzują się wysokim stężeniem potasu i niskim stężeniem sodu, większość psich erytrocytów ma niskie stężenie potasu wewnątrzkomórkowo i w większym stopniu polega na pompach wapniowych i wymianie sodu-wapnia, aby zapobiec obrzękowi komórek. Te różnice w stężeniach elektrolitów mogą prowadzić do wcześniejszych zmian kształtu przechowywanych psich erytrocytów w porównaniu z ludzkimi.

Szczególnie obiecująca okazała się kombinacja analogu witaminy E i kwasu askorbinowego, które działają synergistycznie – VE neutralizuje wolne rodniki, szczególnie rodniki hydroksylowe, podczas gdy AA nie tylko wykazuje pewne właściwości zmiatania wolnych rodników, ale także może regenerować utlenione formy innych antyoksydantów, przywracając je do stabilnego stanu.

Podczas przechowywania erytrocytów ROS gromadzą się z powodu rozpadu składników komórkowych, w tym peroksydacji lipidów błony komórkowej i autooksydacji hemoglobiny, która jest znaczącym źródłem ROS, a w szczególności rodników hydroksylowych. Analogi witaminy E, podobnie jak wszystkie tokoferole, są szczególnie zdolne do neutralizacji rodników hydroksylowych poprzez donację jonów wodoru.

Jak wyniki badania przekładają się na praktykę weterynaryjną?

Jakie są praktyczne implikacje tych wyników dla weterynarii transfuzyjnej? Dodanie antyoksydantów do przechowywanych koncentratów krwinek czerwonych może potencjalnie zmniejszyć ryzyko reakcji poprzetoczeniowych i poprawić skuteczność transfuzji. Jednak przed wprowadzeniem takich modyfikacji do rutynowej praktyki banków krwi konieczne są dalsze badania w celu optymalizacji stężeń antyoksydantów i oceny ich bezpieczeństwa.

Wielkość próby w tym eksperymentalnym badaniu została określona przy użyciu podejścia równania zasobów, w którym 10-20 stopni swobody przyjęto jako akceptowalny zakres dla równania. Przy trzech grupach leczenia i czterech powtarzanych pomiarach (dni 1, 7, 28 i 42) obliczono, że potrzebne jest od 6 do 9 psów.

Badacze przyznają, że ich badanie miało pewne ograniczenia, w tym stosunkowo małą próbę i brak konsensusu co do najlepszych metod oceny stresu oksydacyjnego. Sugerują również, że przyszłe badania mogłyby wykorzystać N-acetylocysteinę amidową (NACA) zamiast NAC, ponieważ ma ona lepszą biodostępność i może wykazywać silniejsze właściwości antyoksydacyjne przy niższych dawkach.

NACA ma lepszą biodostępność w porównaniu z NAC w ludzkich erytrocytach in vitro dzięki dodaniu grupy amidowej do karboksylu, co zwiększa rozpuszczalność w lipidach, umożliwiając lepszą przepuszczalność przez błony. NACA wykazała obiecujące wyniki w ludzkich badaniach in vitro i modelach mysich, demonstrując lepsze właściwości antyoksydacyjne przy niższych dawkach w porównaniu z NAC w zaburzeniach erytrocytów związanych ze stresem oksydacyjnym, takich jak anemia sierpowata i zatrucie acetaminofenem.

Czy warto rozważyć modyfikację protokołów przechowywania krwi w praktyce weterynaryjnej? Wyniki tego badania sugerują, że dodatek antyoksydantów, szczególnie kombinacji witaminy E i kwasu askorbinowego, może stanowić obiecującą strategię ograniczania stresu oksydacyjnego podczas przechowywania psich pRBC. Może to prowadzić do poprawy jakości produktów krwiopochodnych i zmniejszenia ryzyka powikłań transfuzji.

Warto zauważyć, że to badanie stanowi jeden z pierwszych kroków w kierunku optymalizacji przechowywania krwi w medycynie weterynaryjnej z wykorzystaniem dodatków antyoksydacyjnych. Mechanizmy ochronne i optymalne stężenia tych substancji wymagają jeszcze dokładniejszego zbadania, zanim będą mogły zostać wprowadzone do standardowych protokołów banków krwi.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie wykazało, że dodatek antyoksydantów może skutecznie ograniczać stres oksydacyjny podczas przechowywania psiej krwi. W eksperymencie wykorzystano 9 jednostek psich koncentratów krwinek czerwonych, które podzielono na trzy grupy: kontrolną oraz dwie grupy otrzymujące różne kombinacje antyoksydantów. Najlepsze rezultaty osiągnięto przy zastosowaniu kombinacji witaminy E i kwasu askorbinowego, która znacząco zmniejszyła akumulację reaktywnych form tlenu w porównaniu z grupą kontrolną. Mimo redukcji stresu oksydacyjnego, we wszystkich grupach obserwowano podobny spadek poziomu glutationu oraz zmiany morfologiczne erytrocytów. Wyniki sugerują potencjalne korzyści z modyfikacji protokołów przechowywania krwi w praktyce weterynaryjnej, jednak przed wprowadzeniem zmian konieczne są dalsze badania optymalizacyjne.